DNA的限制性酶切及电泳分析实验方法？

1. 反应体系的建立：⑴ 在一无菌1.5 ml Eppendorf管中加入：?无菌双蒸水 7 μl?10×酶切缓冲液 2 μl?质粒DNA(100 ng/μl) 10 μl?EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl?总体积为20μl⑵ 轻轻混匀，12000 rpm离心5 sec。

2. 37 ℃水浴1 h。3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通过加热使酶失活以终止反应。4. 12000 rpm离心5 sec，将管盖及管壁上的水离下。5. 取10 μl消化产物，与2 μl 6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100 V 30～60 min。6 结果观察。操作注意事项：1. 吸样量一定要准确2. 为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶3. 要求在冰上操作，并充分混匀，4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。限制性内切酶酶解中常见的问题和原因1. DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活;②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等;③非限制性内切酶最佳反应条件;④酶切位点被修饰;⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。2. DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确;②DNA不纯或反应条件不佳;③酶切位点被修饰;④部分DNA溶液粘在管壁上;⑤酶切后DNA粘末端退火。3. DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力;②存在第二种限制性内切酶污染;③样品DNA中含有其它DNA。可以到生物帮上查找这方面的信息啊，那里拥有生物领域内丰富的资源，有空的话，可以去 www.bio1000.com/zt/dna/164670.html 那里看下啊。